¿Cómo se realizan los métodos y estrategias de investigación?
Ablación experimental
Producción de lesiones debajo del cráneo: se anestesia al animal, se
corta cuero cabelludo , se extrae parte cráneo, se corta duramadre, se aspira
el tejido cerebral utilizando un dispositivo de succión (pipeta de
vidrio con bomba de vacío).
Lesiones de regiones subcorticales (debajo corteza): se pasa
corriente eléctrica a través de un electrodo de acero inoxidable cubierto de
barniz aislante, se guía al electrodo mediante método estereotáxico, se
conecta aparato de producir lesiones que produce corrientes de radiofrecuencias
(frecuencia muy elevada), produce alta temperatura que destruye células
cercanas.
Inconveniente:
destruye todo lo que se encuentra en la vecindad de la punta del electrodo,
incluyendo somas y axones.
Lesiones excitotóxicas: se inyecta a través de una cánula un
aminoácido excitatorio (ácido caínico), la sustancia destruye los somas pero
respeta los axones
6-hidroxidopamina (6-HD): se inyecta directamente en regiones
determinadas, es captada por los transportadores de moléculas de los axones y
los botones terminales de las neuronas dopaminérgicas y noradrenérgicas, la
sustancia intoxica y destruye las neuronas
Lesiones falsas: se anestesia a cada animal, se le coloca en
aparato estereotáxico, se le abre el cuero cabelludo, se le trepana el cráneo, se
inserta electrodo o canaula, pero NO se activa el dispositivo de lesión
Lesión temporal o reversible:
Se inyecta
anestésico local o muscimol, bloquea los potenciales de acción en los
axones que entran o salen de esa región
Muscimol:
fármaco que estimula los receptores GABA, inactiva región encéfalo inhibiendo a
las neuronas allí localizadas
GABA: principal neurotransmisor inhibitorio en el encéfalo
Enfriamiento
del tejido nervioso, se implanta quirúrgicamente instrumento (criodo) entre
el cráneo y el encéfalo, se hace circular un líquido frío a través de los tubos
de acero inoxidable
Cirugía estereotáxica: localizar estructura neural en una de las páginas
de un atlas estereotáxico, determinar coordenadas respecto a bregma, se
anestesia al animal, se le coloca en el aparato estereotáxico, se hace
incisión en el cuero cabelludo, se localiza bregma ,se marcan los números
apropiados en el aparato, se taladra el cráneo, se introduce el dispositivo en
el encéfalo hasta las coordenadas correctas, se practica la lesión con la cánula
o electrodo, se cose la herida, se retira al animal del aparato, se deja que se
recupere de la anestesia.
Cada
página del atlas estereotáxico está identificada conforme a la distancia de
la sección anterior o posterior respecto a bregma. La cuadricula de cada página
indica las coordenadas de las estructuras cerebrales en el plano ventral a la
parte superior del cráneo y lateral a la línea media
Aparato
estereotáxico incluye soporte para la cabeza, que mantiene el cráneo del
animal en la ubicación adecuada; soporte para el electrodo; mecanismo de
graduación por el que se mueve éste ultimo soporte en distancias ponderadas a
lo largo de los tres ejes espaciales: anterior-posterior, dorsal-ventral y
lateral-medial.
Métodos histológicos: se sacrifica al animal mediante sobredosis de
un anestésico general, se perfunde el tejido (se abren los vasos
sanguíneos y se sustituye la sangre por solución salina), se extrae el encéfalo del cráneo, se coloca en un recipiente que
contiene el fijador ,se secciona en delgadas láminas con un
micrótomo, se montan sobre protaobjetos de vidrio, se tiñen sumergiendo
el portaobjetos en diversas soluciones químicas (azul de metileno o violeta de
cresilo), se cubre con un líquido trasparente (medio de preparación), se coloca
un cubreobjetos sobre ellas, se examina con el microscopio electrónico
Microscopio electrónico: se pasa un haz
de electrones de un lado a otro del tejido a examinar, una sombre del mismo se
proyecta sobre una placa fotográfica, la cual queda revelada por los
electrones.
Microscopio electrónico de barrido: examina
el tejido mediante un haz móvil de electrones, la información recibida por la
reflexión del haz se utiliza para producir una imagen tridimensional muy
detallada.
Marcado de axones eferentes (anterógrado): se inyecta una pequeña cantidad de lecitina PHA-L utilizando
un aparato estereotáxico, las moléculas de PHA-L son captadas por las dendritas
y transportadas a través del soma al axón, viajando mediante transporte
axoplasmático rápido hasta los botones terminales, las células están llenas de
PHA-L en su totalidad, se sacrifica al animal, se secciona el encéfalo, se
acoplan las secciones en portaobjetos, se aplica el método inmunocitoquímico
con el cual se sumerge las secciones frescas de tejido en una solución que
contiene moléculas de anticuerpo/colorante, estos se unen a su antígeno, se
examina al microscopio bajo una determinada longitud de onda y pueden verse las
secciones que contienen el antígeno.
Sistema
inmunitario: cuando los antígenos (proteínas o péptidos) presentes en la
superficie del microorganismo invasor entran en contacto con los anticuerpos
(proteínas) que los reconocen, estos desencadenan el ataque de los leucocitos
sobre el invasor.
Marcado de axones aferentes (retrogrado): se inyecta una pequeña
cantidad de oro fluorado àes
absorbido por los botones terminales y transportada a los somas mediante
trasporte axoplasmático retrogrado, se sacrifica al animal, se secciona
encéfalo, se examina el tejido bajo una luz de la longitud de onda adecuada,
las moléculas de oro fluorado emiten fluorescencia bajo esta luz
Marcado transneuronal: se inyecta virus de la seudorrabia
directamente en una región cerebral, es captado por las neuronas del lugar y
las infecta, se extiende a través de las neuronas infectadas, es liberado,
contagiando la infección a las neuronas con las que establece conexiones
sinápticas, algunas neuronas son destruidas y otras sobreviven (cuanto más
tiempo tras inyectar el virus, más neuronas infectadas), se sacrifica al
animal, se secciona encéfalo, se aplican métodos inmunocitoquímicos para
localizar proteína producida por el virus.
Tomografía axial computarizada (TAC): se coloca la cabeza del
paciente en un amplio cilindro con forma ovalada que contiene un aparato de
rayos X y un detector de rayos X, el haz de rayos X pasa a través de la cabeza
del paciente, el detector mide la cantidad de radioactividad que se transmite, este
haz explora la cabeza desde todos los ángulos, un ordenador convierte los
valores que recibe del detector en imágenes del cráneo y su contenido, solo
pueden obtenerse imágenes en plano horizontal.
Resonancia magnética (RM): se coloca el cuerpo de un sujeto en un
intenso campo magnético ,los núcleos de algunos átomos de moléculas del
organismo rotan siguiendo una determinada alineación, se hace pasar una onda
de radiofrecuencia a través del cuerpo, los núcleos emiten ondas de radio, el
equipo de RM se ajusta para detectar la radiación procedente de los
átomos de hidrogeno porque diferentes moléculas emiten energía a diferentes
frecuencias, el equipo utiliza la información para elaborar imágenes de
secciones del encéfalo, pueden obtenerse imágenes en plano horizontal, sagital
o frontal
·
Registro
y estimulación de la actividad neural
Microelectrodo de vidrio: se calienta la zona media de un tubo capilar
de vidrio, se estiran con fuerza sus extremos con la ayuda de un tirador de
microelectrodos, el tubo se va haciendo cada vez más delgado hasta que se
quiebra obteniéndose dos microelectrodos, estos se rellenan de un líquido
conductor como solución de cloruro de potasio
Microelectrodos de cables: juego de cables muy finos unidos en un
manojo, se aíslan con un barniz quedándose las puntas sin cubrir
Ventajas
Los cables son
flexibles para poder seguir los movimientos de la cabeza del animal,
reduciéndose la posibilidad de dañar las neuronas.
Se puede
registrar la actividad de varias neuronas individuales de una región
concreta del encéfalo.
Registro con microelectrodos: se implantan los electrodos en el
encéfalo de los animales mediante cirugía estereotáxica, se conectan a
unos zócalos de conexión eléctrica en miniatura, se fijan al cráneo con
un cemento dental, recuperación del animal, se conecta al sistema de
registro, se amplifican las señales detectadas por los microelectrodos, estas
señales se pueden ver en un osciloscopio y almacenarse en un ordenador para
analizarlas.
Registro con macroelectrodos: se coloca en el sujeto discos de
metal pegados al cuero cabelludo con una pasta especial que conduce la
electricidad, los amplificadores biológicos envían señal eléctrica a las
manecillas de grandes voltímetros del polígrafo, las cuales se mueven hacia
arriba y abajo, estas manecillas escriben sobre una larga tira de papel (electroencefalograma
EEG), la cual avanza mediante un mecanismo que contiene el polígrafo
Magnetoencefalografía: se realiza mediante neuromagnetometros, contienen
una matriz de varios SQUIDs, el ordenador examina su emisión y calcula el
origen de señales determinadas en el encéfalo
SQUIDs:
detectan campos magnéticos sumamente pequeños, los campos magnéticos son
producidos cuando una corriente eléctrica fluye a través de un conductor:
cuando los potenciales de acción se transmiten a lo largo de los axones //o
cuando los potenciales postsinápticos se transmiten por las dendritas // o se
propagan de un lado a otro de la membrana somática de una neurona
Registro de la actividad metabólica y sináptica del cerebro:
Si la actividad neural de una
región aumenta, el índice metabólico también lo hace, como consecuencia
del mayor funcionamiento de las bombas iónicas de la membrana de las células
2-desoxiglucosa y autorradiografía: se inyecta 2-desoxiglucosa
(2-DG) radiactiva en el torrente circulatorio, es transportada al interior
de las células porque es similar a la glucosa (principal fuente de energía), las
células más activas, consumen más glucosa y por tanto alcanzan mayor
concentración de 2-DG radioactiva que no se metaboliza, se sacrifica al animal,
se prepara autorradiografía, se monta una sección del encéfalo sobre un
portaobjetos, se lleva a una habitación oscura, se cubre con una emulsión
fotográfica, varias semanas después se revela la sección exactamente igual que
una película fotográfica, en la emulsión revelada se ponen de manifiesto las
moléculas de 2-DG radioactiva como puntos de gránulos plateados, las zonas más
activas del encéfalo contienen el mayor grado de radioactividad
Método Fos: se estimulan determinadas neuronas, activan genes de
expresión temprana, se producen proteínas especificas (como proteína Fos), se
unen a los cromosomas del núcleo, indican que las neuronas se acaban de activar, se extrae el encéfalo y se
secciona, se tiñe la proteína Fos, cuanto más proteína nuclear Fos, mayor
activación neural
Tomografía por emisión de positrones (TEP): se inyecta 2-DG, se coloca la cabeza del paciente en
un aparato similar al de un TAC, el equipo TEP detecta las partículas
subatómicas (positrones) emitidas por las moléculas de 2-DG en descomposición, el
ordenador determina cuales son las regiones del encéfalo que han absorbido la
sustancia radioactiva, crea una imagen de una sección del encéfalo, mostrando
el nivel de actividad de las diferentes regiones
Inconveniente:
coste de funcionamiento: las sustancias radioactivas tienen una vida media muy
corta y por lo tanto se necesitan un ciclotrón (acelerador de partículas atómicas)
para producirlas en el lugar donde van a ser utilizado
Resonancia magnética funcional (RMf): mide el metabolismo regional
detectando los niveles de oxígeno en los vasos sanguíneos del encéfalo
Ventajas:
consigue imágenes con gran rapidez// tiene mayor resolución que las de
TEP//dejan ver una información más detallada sobre la actividad de regiones específicas
Medida de las secreciones cerebrales
Microdiálisis: se utiliza cirugía estereotáxica de forma que la
punta de la sonda se sitúe en la región en la cual se está interesado, se
bombea una pequeña cantidad de diálisis a través de uno de los pequeños tubos
de metal, el líquido circula por el tubo de diálisis, pasa al segundo tubo de
diálisis de donde se recoge para analizarla, arrastrando moléculas del líquido
extracelular del encéfalo, empujadas a través de la membrana por la fuerza de
difusión, se analiza el contenido del líquido mediante un método analítico muy
sensible, detecta neurotransmisores liberados por los botones terminales y
dispersados desde el espacio sináptico al resto del líquido extracelular
Estimulación de la actividad neural
Estimulación química: se coloca cánula de metal (cánula guía) en el
encéfalo, se fija con cemento, se coloca cánula más fina dentro de la cánula
guía, se inyecta sustancia (el animal tiene libertad de movimiento)
-
Inconveniente: es más compleja que la
eléctrica
-
Ventaja: activa los somas pero no los
axones Microiontoforesis: se rellena
la micropipeta múltiple con un neurotransmisor, neuromodulador, hormona o
fármaco àel
pH se ajusta de forma que las sustancias se ionicenàse hace pasar corriente
eléctrica a través de una de las micropipetasàse
descargan algunas moléculas de la sustanciaàel
microelectrodo de registro detecta la actividad neural de la célula que está
siendo expuesta a una de las sustancia que contienen las micropipetas
Iontoforesis:
transporte de iones
Estimulación magnética transcraneal (EMT): se coloca la bobina de estimulación
con forma de 8 sobre el cráneo, se sitúa el punto medio del 8 justo encima de
la región que se quiere estimular, los pulsos de actividad eléctrica envían
campos magnéticos que activan las neuronas corticales
·
Métodos
neuroquímicos
Hibridación in situ:
Sintetizar proteína, la información necesaria se copia de un
cromosoma a un segmento de ARN mensajero : sale del núcleo, se desplaza hasta
los ribosomas Y síntesis de proteínas
Proteína: está
codificada en términos de una secuencia específica de bases de nucleótidos que
componen el ARN mensajero
Si se conoce
código
Se sintetiza
un segmento de ARN radioactivo, que contiene una secuencia de nucleótidos
complementarios de la secuencia del ARN mensajero, Tejido cerebral se expone al
ADN radioactivo, se adhiere a moléculas de ARN mensajero, uso de autorradiografía
para localizar ARN mensajero y por tanto la de las células que producen la
proteína cuya síntesis única el ARN.
Localización de receptores específicos:
1. Se
exponen secciones de tejido cerebral a una solución que contiene un ligando
radioactivo para un receptor especifico, se enjuagan las secciones para que la
única radioactividad sea la del ligando, se utilizan métodos autorrafiográficos
para localizar ligando
2. Método
inmunocitoquímico
Los conocimientos que aquí plasmamos están inspirados y basados en ambos códices.
ARTÍCULO RESUMEN
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En este artículo extraído de una web podréis leer a modo de resumen más información sobre este tema.
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